京都大学 大学院医学研究科 人間健康科学系専攻 病理学研究室（形態形成医療科学）

病院等でみられる医療用に普及しているCTは、X線が物質を透過する際の透過率（吸収率）の変化をコントラストとして三次元の画像にするものです（吸収コントラストX線CT法）。これに対して、位相コントラストX線CT法は、X線が物質を透過する際に生じる位相変化をコントラストとして三次元の画像にする方法です。X線の吸収率が小さい軽元素（水素、炭素、酸素など）で構成されている生体試料では、従来の吸収コントラストX線CT法に比べて分解能を1000倍も高くすることができます。共同研究者である山田重人博士は、高エネルギー加速器研究機構 (KEK;筑波)の研究施設(Photon Factory)を共同利用してヒト胚子の高解像度データを取得する研究を進めています。得られた貴重な撮像データを私たちは解析に用いています。

位相CTの原理

三次元イメージング法のうち、マイクロＸ線ＣＴは、ヒト胚のような柔らかい標本では通常のＸ線ＣＴでは透過してしまい撮像ができません。またＭＲ顕微鏡では詳細な解析に至る解像度が得られていません。そこでわたしたちは、位相Ｘ線顕微鏡(位相CT)を用いることにいたしました。 位相CTは波としてのＸ線は物質を透過すると位相がシフトすることを利用し、この位相差を画像化することで、従来の吸収Ｘ線によるイメージングの1000倍の感度を実現したもので、解像度はＭＲ顕微鏡の１０倍近くになる可能性があります（図１）。日立・高エネ研・北里大の共同研究グループが開発した撮像システムは、（BL-14C）に常設されています[3-5]。

BL-14Cに常設された位相CT装置は、非対称結晶を用いた拡大ミラー、分離型X線干渉計位置決め機構、画像検出器、試料位置決め機構、フィードバック機構から主に構成されています。BL-14の垂直ウィグラーから放射されたX線はSi(220)結晶で単色化され、さらに非対称結晶により横方向に拡大されて、X線干渉計に入射します。干渉計で形成された干渉ビームのうち一方は画像検出器で検出し、他方はフィードバック用として利用します。試料は基礎から独立した位置決め機構により、干渉計の光路に設置します。

3次元測定は、試料をX線に対して回転して行います。標本はアガロースゲルに包埋し、そのゲル塊を回転台に固定する方法をとります（図３）。標本はBL-14Cに常設された位相コントラスト型イメージングシステムの標準的な試料ステージを用いて設置します。標本の大きさは最大3cm程度であり、上記ステージで十分な位置決めを行うことができます。標本は水で満たしたセル内に設置します。これは標本の蒸発を抑制すると同時に、空気と標本の大きな密度差を低減するためです。CTを実施するために、標本を固定した棒をセル外からモータにより回転させます。

位相CT撮像の実際

現在、割り当てられたビームタイムに合わせてヒト胚子標本を施設に持ち込んで撮像をしています。1体あたりの撮像に3−6時間かけ、1日4−6体、ほぼ24時間、装置を稼働しております。たまに訪れるビームダンプと地震は難敵で、再撮像を余儀なくされることがあります。あとは、過酷なつくばの気候（特定のメンバーが連れてくるという噂もあります）。

プロジェクトの現状と成果

ヒト胚子の位相CT撮像法としては一定の手法を確立した状態で、撮像標本数も200程度になりました。それらを用いて、全身様々な部位の器官、組織等の発生に伴う変化を解析しています[1]。位相CTを用いることで、貴重な標本を破壊せずに解析できます。また、撮像された画像は立体構築が正確であることから、三次元的な形態観察、計測に適しています。くわえて、二次元の断面像を任意に取れる、レンダリングにより臓器の位置の把握が容易である、多くの個体をコンピューター上で比較検討しやすいなど、デジタルデータならではの多くの長所があります。これらの長所を生かしたヒト胚子研究はほとんどなく、得られる知見は大変有意義です。

今後の課題

グループの米山らは、「X線干渉法を用いたZeffイメージング法」(標本内の実効原子番号の空間分布を画像化する方法)の開発を進めています [6]。新規の観察手法ですが、これまでと標本準備や機器のセッティングは同じで、位相イメージングに加えて吸収像の撮影を追加するだけで元素に関する情報を画像化可能であるという点が大きな利点です。この手法で生物標本を網羅的に観察した例は皆無です。Zeff法を用いることで、器官発生に伴う質的な変化、代謝による物質の合成、貯留を定量、組織構造の形成に伴う物質分布の変化についての情報を付加することが可能です。発生に伴う代謝や機能的な変化、組織構造学的な変化について新たな知見を得、発展に貢献すると思われます。また、その異常についても捉えられる可能性があることから先天性代謝疾患、中毒性疾患についても新たな知見が得られる可能性があります。また、より安定した実験装置周辺環境で、より高い空間分解能、濃度分解能の画像を得るためのビームライン、X線干渉計の高度化に関する検討や加速器の先生方とともに挿入光源の高度化に関する検討も行なっています。

参考文献

[1] Takakuwa T. 3D analysis of human embryos and fetuses using digitized datasets from the Kyoto Collection. Anat Rec 2018；301: 960-969 doi: 10.1002/ar.23784

[2] Yamaguchi Y, Yamada S. The Kyoto Collection of Human Embryos and Fetuses: History and Recent Advancements in Modern Methods. Cells Tissues Organs 2018; 205: 314-319. doi: 10.1159/000490672.

[3] Yoneyama A, Yamada S, Takeda T. Fine biomedical imaging using X-ray phase-sensitive technique. In: Gargiulo DG, Mcewan A, editors. Advanced biomedical engineering. Rijeka: InTech; 2011. pp. 107-128.

[4] Yoneyama A, Takeda T, Tsuchiya Y, Wu J, Lwin TT, Koizumi A, Hyodo K, Itai Y, A phase-contrast X-ray imaging system-with a 60 × 330 mm field of view-based on a skew-symmetric two-crystal X-ray interferometer. Nucl Instrum Methods Phys Res A. 2004; 523: 217-222.

[5] 兵藤一行. 放射光位相コントラストイメージングで展開されるサイエンスへの期待. 表面と真空 2019; 62: 66-71.

[6] Yoneyama A, Hyodo K, and Takeda T, Feasibility test of Zeff imaging using x-ray interferometry. Appl Phys Let 2013；103：204108.

胚子期後半に頭部の外表に赤いはちまきのような輪を観察することができる。網状の血管が互いに癒合している。血管形成の最先端である (Finley 1922)。

受精後約3週、絨毛膜を開いて現れた胚子はわずか3.1mm、頭尾、体節を持ち心臓も既に拍動している。この時期の、自然の直立した形を保った胚子は世界的にもまれで、耽美的ですらある.当時の論文の図の多くは精巧な版画によるものが多い。この発生段階10のヒト胚子はillustrator Diduschの傑作のひとつ（銅版画）である[Stage 10 human embryo; Contrib Embryol 20; 81, 1929]

1961年、京都大学医学部解剖学第三講座 の西村秀雄教授は、人工妊娠中絶によって得られたサンプルを協力産婦人科医により収集するプロジェクトを開始しました。当時、妊娠初期につわり等の薬としてサリドマイドを服用した方から、短肢症等の先天異常児がうまれる危険性があることが顕在化し、社会問題となっていました。1975年「ヒトの胎児医学と先天異常の予防」に関する研究を目的として先天異常標本解析センターが設置されました。1961年以来収集されてきたヒト胚子および胎児の標本とその記録が保存され、これまでに集められた標本数は44,000例に上っています（京都コレクション）。器官形成期に当たる受精後8週までの損傷のない胚子約1,000例は、全身の連続組織標本として保存されており、そのうち特に上質のもの474例はヒト胚子の国際登録に含まれ、その例数は米国カーネギー発生研究所の617例に次ぐものとなっています。このように京都コレクションは質・量ともに世界最大規模のものであり、国内外の関連分野の研究者の利用に供されています。

また先天異常標本解析センターでは、現在、先天異常の初期病理発生過程の研究、遺伝疫学的方法による各種先天異常の病因解明、さらに実験的研究による先天異常の発生メカニズムや予防に関する研究を推進しており、ヒト発生学および先天異常研究の世界的な中心の一つとなっています。
京都コレクションは、二度と得ることができない大変貴重な標本群といえます。ですから、将来の不測の事態などに備えると共に、ヒトの発生学、遺伝学に寄与するために恒久的な保存が必要です。そこで京都コレクションを使用した器官形成期から出生までの各発生段階の胎児のＭＲ画像のデータベース化、さらにＭＲ断層画像、連続切片像から、各発生段階の胎児の形成および主要臓器の三次元立体画像を作成・データベース化する「ヒト胚の三次元データベース構築」事業が科学技術振興機構バイオインフォマティクス推進事業(2005-11)に採択され実施されました。（代表；塩田浩平教授、 筑波大学大学院　数理物質科学研究科(巨瀬研究室）などとの共同）

 

京都コレクションは他に、次のような特長があります。

1)当コレクションは、殆どが人工妊娠中絶由来で特別な選択をかけていないので、妊娠初期の子宮内の胚子集団を反映している

2)大多数は受精後３～８週の「器官形成期」の標本で、重要な発生段階に相当する。

3)外形異常胚が多く含まれている（Matsunaga & Shiota, Teratology, 1977）。

4) 各症例のマクロ写真、書誌データ（妊娠歴、標本観察データなど）を有する。

5) 外表正常および異常の約500例のヒト胚連続組織切片を有している。

 

子供は大人の相似形であるーというと、多くの人は反論するでしょう。少なくとも医療に従事する人でそんな乱暴な考えをもつ人はいるまい。では、ヒトの胚子の胃はどうでしょうか。最近の発生学の教科書で胃の発生の項をみますと、その絵の多くは、胃薬のコマーシャルに書かれるような絵で、本によっては「大人と相似形である」と堂々と書かれたものもあります。多分最近の教科書で勉強した医学生はヒトの胃は大人と相似形であると信じて疑わないのではないでしょうか。

デジタル化の恩恵で、以前だったら探しだすのを諦めるような古い文献も用意に入手できるようになりました。文献を遡り、ちょうど100年前にLewisという人が書いた論文に胃の形態に関するものがあります。(Am J anatomy 1912)

この論文は数例の胃の立体像の観察を記したもので、現在の教科書の胃の形態とは大きく異なります。はたして、研究材料として使用しているMRI dataをもとにわれわれがヒト胚子期の胃の形態を３次元化したところ、随分変わった形の胃が出来上がりました(8. Kaigai et al, 2014)。それはまさにLewisの絵の特徴と一致していました。そして、同じ時期のものでも個体による差があるということ、ヒト胚子の胃は十人十色であるということが新たにわかりました。

生化学や分子生物学等の進歩は実験発生学の発展をもたらしました。一方で記述中心の古典的な発生学、とくにヒトを材料とした発生学は1960年代を境にあまり行われなくなりました。私たちが研究を進める上で参考にする論文は、Lewisの胃の論文のような古典的なものがしばしばあります。実に忠実に描出された形態模写をみると、私たちの観察結果についての支持がえられた安堵感とともに、いにしえの研究者と時空を超えた交流を通して、その熱情に触れ、学術的な論文でありながら心温まるものがあります。

8. Kaigai N, Nako A, Yamada S, Uwabe C, Kose K, Takakuwa T, Morphogenesis and three-dimensional movement of the stomach during the human embryonic period, Anat Rec (Hoboken). 2014 May;297(5):791-797. doi: 10.1002/ar.22833 ,  2014 May;297(5):C1. doi: 10.1002/ar.22774. (概要), [OpenAccess]